项目背景

　　膀胱癌(Bladder cancer)是泌尿系最常见的恶性肿瘤，其治疗手段仍以手术治疗为主，化疗、免疫治疗相结合的综合治疗方案。其中化疗抵抗患者往往伴有很高的复发和转移率。因此，深入研究膀胱癌化疗耐受过程，阐明调控机制并转化应用，对于改善膀胱癌患者预后及存活率，具有重要科学意义和临床价值。

　　STAT3参与多种肿瘤的调控，其异常表达已在如乳腺癌、胃癌、头颈癌等多种恶性肿瘤中获得验证，STAT3也可调控膀胱癌发生发展，其在膀胱癌组织中高表达，而在正常膀胱组织中低表达。STAT3是否参与了晚期膀胱癌化疗耐受的调控以及可能的作用机制还未见报道。

　　前期研究发现，化疗耐受组STAT3表达高于化疗敏感组，高表达STAT3组总生存率明显降低。抑制STAT3可增加细胞对铂类的敏感性。提示STAT3参与了晚期膀胱癌化疗敏感性的调控。基于STAT3在肿瘤发生以及本研究在耐药中的作用，使得STAT3成为一个癌基因，针对STAT3设计靶向药物具有重要意义和应用价值。

　　在此研究的基础上，结合课题组前期建立的RNA干扰（RNA interference, RNAi）药物平台，选择脂质体或者细菌载体，构建特异靶向STAT3的RNAi药物，为临床治疗癌症和克服耐药提供数据和平台支持。

　　本项目拟通过实验明确STAT3对膀胱癌化疗敏感性的影响；明确STAT3通过DR5调控膀胱癌细胞死亡受体信号通路；阐明STAT3通过内质网应激eIF2a/ATF4/CHOP通路调控DR5表达。

　　本项目总体研究目标是阐明STAT3在膀胱癌化疗耐受中的作用，明确STAT3通过内质网应激凋亡蛋白CHOP调控DR5依赖的死亡通路影响化疗敏感性的机制，同时研发靶向STAT3的RNAi药物，为临床治疗膀胱癌和克服耐受提供方向和实验依据。

　　为了响应国家不断深入并提升医疗水平的精神。北京医学奖励基金会特设立“转录因子STAT3调控晚期膀胱癌化疗敏感性的机制及应用研究”项目。

　　项目内容

　　1.实验明确STAT3对膀胱癌化疗敏感性的影响

　　（1）体外实验明确STAT3对膀胱癌细胞药物敏感性的影响

　　体外培养膀胱癌细胞(HCT116, LOVO, HCT8)，利用STAT3 shRNA、STAT3高表达质粒以及STAT3抑制剂，给予铂类和TRAIL作用，明确STAT3表达对膀胱癌细胞药物敏感性的影响。体外构建耐受铂类的HCT116和HCT8细胞，RT-PCR和Western Blotting比较耐药细胞和敏感细胞STAT3表达情况。

　　（2）体内动物实验验证STAT3对膀胱癌药物敏感性的影响

　　建立人源化小鼠和临床组织样本建立膀胱癌PDX动物模型，利用STAT3shRNA干扰或过表达的细胞系建立裸鼠模型，给予铂类和TRAIL作用，检测肿瘤生长速度，利用RT-PCR，Western blotting对明确STAT3表达与膀胱癌药物敏感性之间的关系。

　　2.明确 STAT3通过DR5调控膀胱癌细胞死亡受体凋亡信号通路

　　（1）死亡受体信号通路参与STAT3调控膀胱癌细胞存活和凋亡

　　构建caspase-8 shRNA膀胱癌细胞，转染siRNA STAT3质粒或给予STAT3抑制剂，流式细胞术、CCK8、平板克隆和Western Blotting检测膀胱癌细胞存活率、增殖率、凋亡率以及凋亡相关蛋白表达。

　　（2）阐明STAT3通过DR5调控膀胱癌细胞死亡受体凋亡

　　利用STAT3 shRNA，RT-PCR和Western blotting检测细胞中死亡受体信号通路分子表达；DR5 shRNA细胞，转染siRNA STAT3质粒， 检测cleaved caspase-8表达。

　　3.阐明STAT3通过内质网应激eIF2a/ATF4/CHOP通路调控DR5表达

　　（1）明确STAT3调控化疗药物作用下的内质网应激信号通路

　　利用STAT3 shRNA、STAT3高表达质粒以及STAT3抑制剂，给予铂类和TRAIL作用，电镜观察内质网形态、共聚焦检测内质网应激相关蛋白PDI分布。

　　（2）内质网应激对STAT3调控DR5表达的影响

　　构建BIP shRNA膀胱细胞，转染STAT3 siRNA检测膀胱癌细胞中DR5表达情。

　　（3）STAT3通过CHOP调控DR5表达

　　构建CHOP shRNA膀胱细胞，转染STAT3 siRNA或给予STAT3抑制剂，RT-PCR和Western blotting检测膀胱癌细胞中DR5表达情况。

　　4.STAT3靶向Bcl-xL启动子调控CHOP/DR5/Caspase-8信号通路

　　（1）明确STAT3靶向Bcl-xL启动子调控Bcl-xL表达

　　构建野生型和突变型质粒，利用ChIP和荧光素酶报告实验明确靶向调控作用。

　　（2）阐明Bcl-xL 对STAT3调控CHOP/DR5/Caspase-8信号通路的影响

　　5.应用研究：构建STAT3 RNAi药物，验证其体内外对膀胱癌细胞毒性和化疗药物敏感性

（1）靶向运载siRNA减毒沙门氏菌的设计与构建

　　针对STAT靶向siRNA，合成siRNA，连接到质粒载体，电转化仪转入鼠和人减毒沙门菌种，检测基因沉默效率。

（2）靶向基因沉默对膀胱癌细胞生物学行为的影响。

　　 质粒转染膀胱癌细胞，利用细胞存活、增殖、凋亡、侵袭和迁移实验明确沉默靶向基因对细胞生物学行为的影响。

（3）体内明确携带靶向siRNA减毒沙门菌对膀胱癌生长、转移和免疫应答的影响

　　建立常规C57BL/6小鼠皮下和原位膀胱癌动物模型、建立免疫缺陷动物模型和PDX模型，体内观察生物药物对肿瘤生长、转移和免疫细胞数量的影响。

（4）细菌中试实验

　　大容量的生物反应器上完成工艺验证，并对其毒性及干扰效果进行检测。

　　项目对象

　　膀胱癌细胞、小鼠。

　　项目时间

　　自2023年1月至2024年5月

　　项目联系人

　　肖雨馨 联系电话：18810872779